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磺化NHS-SS-生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)是硫醇可裂解的胺基反应性的生物素化试剂，具有延伸的间隔臂，可以减少与抗生物素蛋白结合的空间障碍。在没有有机溶剂如DMSO或DMF的情况下，该试剂是水溶性的(约10mM)，能够进行生物素化标记。水溶性对于不能耐受有机溶剂的应用和有机溶剂的存在使生物素化方法更复杂这两种情况更有优势。该试剂上的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)与赖氨酸残基的ε-胺基能反应产生稳定的产物。尽管多肽N-末端的α-胺基也能与NHS酯反应，但蛋白质上的α-胺基很少能够发生共轭反应。NHS酯以去质子化的形式与伯胺反应，因此反应需要在中性到碱性的pH范围中进行。伯胺与NHS酯通过亲核反应，释放N-羟基琥珀酰亚胺副产物。水溶液中该反应与NHS-酯的水解存在竞争关系。水解速率随着pH的增加而增加，并且在稀释的蛋白质溶液中更容易发生。

将Sulfo-NHS-SS-Biotin缀合到蛋白质或肽的条件存在着相当大的灵活性。NHS酯反应可以在4～37℃下进行，反应混合物pH范围为7~9，孵育时间可以在几分钟至过夜内进行。组合条件的不同将导致不同程度的生物素标签的结合。由于蛋白质具有变异性，特别是关于可用于缀合的胺的数量不同，，应用于某一种蛋白质最佳的缀合条件可能在应用于其他不同蛋白质时，不会产生最佳结果。

分子量	606.69
间隔臂	24.3 Å
纯度	>95% on TLC
结构式

• Sulfo-NHS-SS-Biotin对湿度敏感，将其放在-20℃下干燥储存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须先平衡至室温。
  
• 避免使用含有胺(如Tris和甘氨酸)的缓冲液，因为胺对反应有竞争性
  
• 避免在生物素化结合期间使用还原剂，以防止间隔臂内的二硫键断裂。试剂在使用前溶解。NHS-酯部分易水解并无活性，因此不要制备用于储存的储备溶液，实验前配制，弃掉所有未使用重构的试剂溶液。

• 需要材料
  
  • 反应缓冲液：磷酸盐缓冲液(例如0.1M磷酸盐，0.15M氯化钠，pH7.2或其他不含胺的缓冲液，pH7.0～8.5)
    
  • 去除未反应的生物素(缓冲液交换)的方法：透析或脱盐柱。
    
  • 还原剂：用于切割二硫键的DTT或2-巯基乙醇。
• 计算
  用于每个反应的生物素试剂的量取决于待标记的蛋白质的量和蛋白质浓度。通过调整使用的生物素与蛋白质的摩尔比，可以控制生物素标记的掺入量。当标记稀释的蛋白质溶液(如2mg/mL)时，与浓缩的蛋白质溶液(如10mg/mL)相比，需要使用更大倍数摩尔量的生物素。为了获得最佳效果，对于2mg/mL IgG溶液，使用≥20倍摩尔量的生物素，对于10mg/mL IgG
  溶液，使用≥12倍摩尔量的生物素。
  
• 生物素化
  
  • 将IgG溶解或交换到反应缓冲液中。
    
  • 使用前制备10mM的Sulfo-NHS-SS-Biotin溶液：6mg Sulfo-NHS-SS-Biotin试剂中加入1mL超纯水。
    
  • 将适量的Sulfo-NHS-SS-Biotin溶液加入到IgG溶液中(具体见B中计算)。
    
  • 冰上孵育2h或室温孵育30min。
    
  • 通过透析或凝胶过滤去除未反应的Sulfo-NHS-SS-Biotin。
    
  • 储存：条件与非生物素化蛋白相同。
    
  • 为了切割间隔臂中的二硫键，在室温下将样品在50mM DTT中孵育2h或在50℃下孵育30min，也可以使用其它还原剂来切割二硫键。

• 用预冷的PBS(pH8.0)洗涤细胞三次，除去杂质。
  
• 在PBS(pH8.0)中，以约25×10⁶个细胞/mL的浓度悬浮细胞。注意：可以使用其他浓度的细胞，基于细胞的浓度，大小或类型调整生物素化试剂的量。
  
• 使用前制备10mM的Sulfo-NHS-SS-Biotin溶液：6mg Sulfo-NHS-SS-Biotin试剂中加入1mL超纯水。
  
• 每mL细胞悬浮液加入约80μL 10mM Sulfo-NHS-SS-Biotin试剂。
  
• 反应混合物在室温下孵育30min。
  
• 用预冷的PBS洗涤细胞三次，除去未反应的生物素化试剂。